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產(chǎn)品僅供研究使用，不適用于人類或臨床診斷
商品屬性：

產(chǎn)品英文名稱：Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Detection kit

產(chǎn)品中文名稱：Annexin V-EGFP/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

規(guī)格：20T/50T/100T

貨號(hào)：EY-01X8541
用途：僅供科研研究實(shí)驗(yàn)

特點(diǎn)&優(yōu)勢:

•  標(biāo)準(zhǔn)化，具有陽性對(duì)照。解決凋亡檢測的非標(biāo)準(zhǔn)化問題

•  熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性更好；EGFP是FITC的替代物，熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性更好

•  適用于流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡

保存建議:-20℃，避光保存12個(gè)月。

運(yùn)輸條件:藍(lán)冰運(yùn)輸

背景

細(xì)胞凋亡（apoptosis）是一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中起著必要的作用。在正常活細(xì)胞中，磷脂酰（PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。膜聯(lián)蛋白V(Annexin V) 是一種分子量為35~36KDa的鈣離子依賴型磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。通過熒光素或者標(biāo)記Annexin V即可簡單快速地直接檢測出細(xì)胞早期凋亡情況。 碘化丙啶（propidine iodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，而早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜是完好的，對(duì)PI有拒染性。但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染上。因此將Annexin V 與PI 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。PI可以被488,532或546nm激光線激發(fā)，并發(fā)出紅色熒光。

本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn):

 1.操作簡便、快捷。可直接加入到檢測平板。在96-孔板中檢測時(shí),無需洗滌或收獲細(xì)胞,免去溶解步驟。

2. 無放射性。不需要配制液閃混合物,也不需要處理廢棄物。

3. 與MTT相比,使用更安全。不需要使用揮發(fā)性的有機(jī)溶劑來溶解甲臜產(chǎn)物。

4. 操作靈活,與MTT不同,平板讀數(shù)后可放回溫箱繼續(xù)孵育,使顏色進(jìn)一步生成。

操作步驟：

(一)獲得目的基因

1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

(二)構(gòu)建重組表達(dá)載體

1、載體酶切:將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點(diǎn))進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

(三)  獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種

1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。

2、 測序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆,重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。

3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。

(四)誘導(dǎo)表達(dá)

1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養(yǎng)。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。

3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實(shí)驗(yàn)組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。

4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。

5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

公司正在出售的產(chǎn)品：

A Beta1-40 (mutation type, MT 0.1mgA Beta1-40 (mutation type, MT) peptide 突變型β淀粉樣肽1-40

FETUB Protein Human 重組人 Fetuin-B / FETUB 蛋白 (His 標(biāo)簽)

CD83重組小鼠 CD83 / HB15 蛋白 (His 標(biāo)簽) Protein

IFNG Protein Rat 重組大鼠 IFNG / Interferon Gamma 蛋白

ABHD14B重組人 ABHD14B 蛋白 (His 標(biāo)簽) Protein

小鼠第八因子相關(guān)抗原(FⅧAg)ELISA 試劑盒

Human fetal hemoglobin (HBF) ELISA Kit 人胎兒血紅蛋白(HBF)檢測試劑盒

HumanHerpessimplexvirus2,HSV-Ag2ELISAKit 人單皰疹病毒抗原2(HSV-Ag2)檢測試劑盒 進(jìn)口分裝

Humanarylhydrocarboeceptor,AhR檢測試劑盒人芳香烴受體(AhR)檢測試劑盒

植物源性食品芥末(mustard)試劑盒20次

Humahymosinα1ELISAKit人肽α1(Thymosinα1)檢測試劑盒

無形體核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)   48T

東方體核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)   48T

人皰疹病毒6型(HHV-6)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)   48T

(OC43/HKU1)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)   48T

大鼠β細(xì)胞素(BTC)檢測試劑盒 ，英文名： BTC ELISA Kit

Mouse esadiol receptor (ER) ELISA Kit 小鼠雌二醇受體(ER)檢測試劑盒

ELISA 小鼠核轉(zhuǎn)錄因子p65(mouse NF-kBp65)  進(jìn)口分裝

CLIAKitforIL-15ELISAKIT大鼠白介素15

通用型馬萊姆癥嗜吞噬細(xì)胞無形體(LymeandAnaplasmaPhagocytophilum)試劑盒20次

ELISAKitANG-R-Tie1大鼠血管生成素受體Tie1

Annexin V-EGFP/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒GREM1重組小鼠 Gremlin 1 / GREM1 蛋白 (His 標(biāo)簽) Protein

蛋白酶激活受體4(PAR4)重組蛋白 Recombinant Protease Activated Receptor 4 (PAR4)

CFL1重組人 CFL1 / N-cofilin 蛋白 (His 標(biāo)簽) Protein

FETUB Protein Human 重組人 Fetuin-B / FETUB 蛋白 (His 標(biāo)簽)

TNFRSF10D Protein Cynomolgus 重組食蟹猴 TRAIL R4 / CD264 / TNFRSF10D 蛋白 (His 標(biāo)簽)